拉曼光譜

眾所周知，1928年，印度物理學(xué)家拉曼通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)**證明了非彈性散射光的存在。后來的學(xué)者以拉曼的名字將這種非彈性散射光命名為“拉曼散射”，與之對應(yīng)的散射光現(xiàn)象稱為“拉曼效應(yīng)”。之后這種被稱為“分子光譜”的光譜技術(shù)逐步成為了研究分子結(jié)構(gòu)的重要手段之一。20世紀(jì)60年代，激光的出現(xiàn)使得拉曼光譜儀系統(tǒng)得到了很大的簡化，檢測的靈敏度提高很多，由此開始，拉開了拉曼光譜真正用于常規(guī)分析和檢測的序幕。

拉曼光譜是在拉曼效應(yīng)基礎(chǔ)上的一種方法，由于其含有的眾多優(yōu)勢已成為檢測和分析方法中的佼佼者，被廣泛應(yīng)用于食品檢測、生物醫(yī)藥、分子結(jié)構(gòu)研究、化工過程、生物化學(xué)、考古及文物鑒定以及法學(xué)樣品分析等各個(gè)領(lǐng)域。學(xué)術(shù)界先后出現(xiàn)了多種常用的拉曼光譜延伸技術(shù)，如表面增強(qiáng)拉曼光譜、共焦顯微拉曼光譜、傅里葉變換拉曼光譜、共振拉曼光譜等。

拉曼光譜技術(shù)因其無需樣品制備過程、快速無損、穩(wěn)定性高的特性，在光學(xué)快檢領(lǐng)域備受推崇。但是，在拉曼光譜技術(shù)擁有眾多優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，信號弱和易受干擾的缺陷也成為限制拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。比如大多數(shù)食品、藥品的拉曼光譜檢測過程都伴有強(qiáng)熒光干擾，熒光的存在嚴(yán)重影響拉曼光譜特征峰的識(shí)別，越來越多的物質(zhì)或是因?yàn)闂l件限制無法獲取高信噪比的拉曼光譜，或是因?yàn)樽陨韽?qiáng)熒光掩蓋了原本就很弱的拉曼信號，導(dǎo)致應(yīng)用受限。

位移差分拉曼光譜（SERDS）技術(shù)原理

熒光抑制

目前，抑制熒光干擾的方法有如下幾種：

一種簡單的方法是加入熒光猝滅劑。但是使用這種方法的時(shí)候必須要保證樣品不會(huì)受到高濃度的熒光猝滅劑干擾，對于生物樣品來說，這基本不可能。

另一種方法是使用比低能量吸收帶更長的波長激光來激發(fā)樣品（預(yù)共振激發(fā)）。利用這一思想的一項(xiàng)重要技術(shù)就是傅里葉變換（FT）拉曼光譜。在很多情況下，用這種方式可以獲得在高熒光中的拉曼光譜信號，但是這種方法有一些嚴(yán)重的缺陷。首先，這種激發(fā)光不會(huì)直接與任何的基團(tuán)發(fā)生共振，在多組分樣本中就不能實(shí)現(xiàn)對特定基團(tuán)的選擇性增強(qiáng)。其次，由于激發(fā)光受限于預(yù)激發(fā)波長，就不能通過吸收帶來測量共振拉曼激發(fā)的輪廓曲線（拉曼強(qiáng)度是激發(fā)波長的函數(shù)）。這是一個(gè)極其嚴(yán)重的缺陷，因?yàn)榉治黾ぐl(fā)光的輪廓曲線對于探測色團(tuán)的激發(fā)電子狀態(tài)特性是很有用的。

還有一種方法是基于拉曼散射和熒光發(fā)射可以在時(shí)間上區(qū)分開來，使用門控和時(shí)間相關(guān)的光子計(jì)數(shù)來提供時(shí)間分辨率。該方法涉及到激光強(qiáng)度的高頻率調(diào)制，不止是激光器的鎖模，還用到了外部的調(diào)制器來調(diào)制激光腔，但是僅在熒光壽命相對較長的時(shí)候才有用。

另一種區(qū)分拉曼信號和熒光背景的方法是設(shè)計(jì)激發(fā)激光的波長調(diào)諧。這種技術(shù)通過向一個(gè)連續(xù)波染料激光器的調(diào)諧元件中引入一個(gè)低頻調(diào)制器而得以實(shí)現(xiàn)。波長調(diào)制技術(shù)可應(yīng)用于任何系統(tǒng)，但其用途受限于對激光波長的低頻調(diào)制和鎖定檢測的專用設(shè)備。

上述的各種熒光消除技術(shù)方法確實(shí)發(fā)揮了一定作用，但是它們的劣勢也是顯而易見。

位移差分拉曼光譜

根據(jù)Kasha's rule，美國加州大學(xué)伯克利分校的研究人員提出了位移差分拉曼方法來解決熒光背景干擾的問題。分子所發(fā)射的光（熒光或磷光）只能從某一多重態(tài)中的低態(tài)激發(fā)，因此對于激發(fā)光的微小偏移并不影響背景（樣品受激發(fā)射光譜）。獲得的拉曼光譜的熒光輪廓幾乎不發(fā)生變化。而拉曼光譜作為散射光譜特征峰出現(xiàn)的位置與激發(fā)光源頻譜位置有固定關(guān)系，當(dāng)激發(fā)光頻率移動(dòng)時(shí)拉曼特征峰會(huì)跟著移動(dòng)。Johannes Kiefer在文章中用寬譜光源進(jìn)行光譜成像，很形象的說明了這一現(xiàn)象。圖中y代表不同激發(fā)頻率，顏色譜代表了接收到的光譜強(qiáng)度。對比下面的光譜圖，可以看中間有很強(qiáng)的一片區(qū)域是中心對稱的，代表了不隨激發(fā)光頻率變化的受激發(fā)射光譜，而窄窄的傾斜光譜則是拉曼光譜。

位移差分拉曼光譜（SERDS），這種技術(shù)基于在兩個(gè)有輕微偏移的激發(fā)激光中收集兩張不同的光譜。首先，與以前的技術(shù)對比，不需要使用特殊的設(shè)備來改變激勵(lì)激光器的波長。其次，使用多通道檢測，從而在給定的信號積分時(shí)間內(nèi)改善了信噪比。對于現(xiàn)在的制冷式非加強(qiáng)CCD探測器，具有非常高的散粒噪聲，信噪比對于這種可以簡單實(shí)現(xiàn)的差分方法是至關(guān)重要的。除了這些特性以外，這種方法對于短壽命的和長壽命的熒光樣品同樣適用。

差分拉曼技術(shù)采用物理和數(shù)學(xué)相結(jié)合的熒光處理方法，常規(guī)流程如下：

首先，需要獲得采用具有已知微小波長錯(cuò)位的光源激發(fā)的拉曼光譜。將光譜的基線對齊，理論上對齊后光譜相減生成的曲線中僅包含拉曼光譜的差分信息。根據(jù)公式：

可以將差分曲線看作拉曼光譜橫軸顛倒后與兩個(gè)δ函數(shù)差的卷積： 

可以對差分曲線積分后，看作拉曼光譜與一個(gè)方波函數(shù)的卷積，通過解卷積的方式獲得真實(shí)拉曼光譜。

實(shí)際操作中雖然兩次差分光譜雖然相差不大，但是由于激光的漂白作用或激光的波動(dòng)，焦點(diǎn)位置的微小變化等各種因素都可能導(dǎo)致光譜曲線的變化。錯(cuò)誤的對齊將在差分拉曼光譜重建過程中被放大，降低拉曼特征提取效果。數(shù)學(xué)操作上，光譜對齊像一個(gè)悖論。我們希望通過光譜對齊通過差分扣除光譜中的熒光部分，分離熒光和拉曼信號；但是只有我們知道準(zhǔn)確的熒光才可能讓光譜熒光的對齊。而如果我們已經(jīng)可以清楚的區(qū)分熒光和拉曼信號，我們則沒有必要對光譜信號進(jìn)行差分。

為了解決這一問題，常規(guī)做法是近似，根據(jù)整個(gè)光譜面積或關(guān)鍵的局部面積作為基準(zhǔn)對譜圖進(jìn)行縮放和平移，使譜圖的匹配基本匹配。然后再對差分后產(chǎn)生的曲線進(jìn)行矯正，如交替小二乘法（ALS）擬合。但是由于擬合目標(biāo)是未知的，所以該方法還存在很多不確定性。

申貝開發(fā)團(tuán)隊(duì)采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，基于任意函數(shù)可以被一個(gè)有三層單元的網(wǎng)絡(luò)以任意精度逼近(Cybenko 1988)這一原理。通過迭代優(yōu)解的方式，同時(shí)將差分、對齊和基線矯正同時(shí)完成。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過幾十次迭代（用時(shí)0.2s）可以準(zhǔn)確分離差分信號和基線偏差。

目前，位移差分拉曼光譜的應(yīng)用場景也在積極開發(fā)中。

德國Ferdinand Braun研究所的研究人員在瑞士的一個(gè)蘋果園采用位移差分拉曼光譜技術(shù)，克服室外背景陽光以及樣品熒光干擾，就蘋果皮和蘋果樹葉進(jìn)行了SERDS測量，獲得了蘋果的指紋特征。該團(tuán)隊(duì)還基于差分拉曼技術(shù)進(jìn)行了針對人體健康的人體皮膚中胡蘿卜素的檢測研究，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)樣品0.05nmol/g的檢出限。

針對紅酒中酒精和甲醇的檢測，眾所周知紅酒具有很高的熒光信號，美國和克羅地亞研究人員，通過位移激發(fā)差分拉曼技術(shù)在譜圖中恢復(fù)了葡萄酒中乙醇和甲醇的光譜，通過400次平均實(shí)現(xiàn)對含量在0.05%甲醇的檢測。

申貝開發(fā)團(tuán)隊(duì)采用785nm，間距1nm的差分拉曼系統(tǒng)，結(jié)合團(tuán)隊(duì)開發(fā)的差分拉曼解調(diào)和去噪算法，對弱激發(fā)下的樣品拉曼特征也進(jìn)行了相關(guān)研究。

科技開發(fā)的目的絕不僅僅是技術(shù)的更新升級，如何能將技術(shù)應(yīng)用與市場熱點(diǎn)需求深入結(jié)合，將科技成果轉(zhuǎn)換為社會(huì)生產(chǎn)力才是關(guān)鍵。Senbe開發(fā)團(tuán)隊(duì)推出的位移差分拉曼光譜技術(shù)新品突破性的解決了拉曼光譜熒光干擾的問題，進(jìn)一步優(yōu)化和完善了拉曼光譜快檢性能，拓寬了拉曼光譜的研究和應(yīng)用領(lǐng)域，對促進(jìn)拉曼光譜領(lǐng)域的科學(xué)技術(shù)與理論發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。期待Senbe開發(fā)團(tuán)隊(duì)以及更多的拉曼領(lǐng)域科研工作者通過不懈的努力去探索和發(fā)展位移差分拉曼光譜這一新興技術(shù)，將**的拉曼光譜技術(shù)轉(zhuǎn)化為科技成果并投入規(guī)?；a(chǎn)，讓便攜式拉曼檢測技術(shù)變得更為實(shí)用和方便。